A történet Rómában játszódik, 1880-ban. Angelotti, Róma volt kormányzója, akit az Angyalvárban tartottak fogva, elszökött, s a Szent András templomban keres menedéket a családi kápolnában, melynek kulcsát nővére a Madonna-szobor alá rejtette. Megtalálja a kulcsot, s sietve elrejtőzik. Épp jókor, mert lépések hangja közeledik a templomban: a sekrestyés csoszog be, hogy előkészítse Cavaradossinak, a festőnek a szerszámait. Hamarosan megérkezik a festő is, és nekilát dolgozni legújabb festményén, mely az imádkozó Madonnát ábrázolja - egy ismeretlen, szőke asszony ihlette ezt a képet. A festő azonban olyan csendben dolgozik, hogy Angelotti azt hiszi, a templom üres és előjön rejtekhelyéről. Mikor megpillantja Cavaradossit, először borzasztóan megrémül, de aztán régi barátját, harcostársát ismeri fel benne, s beszélgetni kezdenek. Ám közben érkezik Tosca is, Cavaradossi kedvese, s Angelottinak újra el kell rejtőznie. Tosca látja a zavarodottságot kedvese arcán, s nem tudja mire vélni. Mivel suttogást hallott, azt hiszi, azt a szép szőke nőt rejtegeti itt valahol Cavaradossi, aki a képen is felismerhető. De a festő megnyugtatja őt, s Tosca nemsokára távozik. A szökevény újra előbújhat, s folytathatják a beszélgetést.
Cavaradossi felajánlja barátjának, hogy rejtőzzön el az ő nyaralójában, s ha ott is keresnék, bújjon el a kútban. Az átszökéssel igyekezni kell, mert már városszerte keresik. Így maga kíséri el tüstént barátját, hogy biztonságban tudhassa.

Alig hogy távoznak, a rendőrfőnök, Scarpia báró megjelenik a templomban, hisz a nyomok ide vezettek. Talál is bizonyítékokat arra, hogy Angelotti megfordult itt, így Cavaradossi is azonnal gyanúba kerül, sőt: a készülő festmény Madonnájában a rendőrfőnök Angelotti nővérét véli felismerni, s fejében már össze is áll a kép: a festő s a szőke szép hölgy volt segítségére Angelottinak a szökésben. Ekkor Tosca is a templomba érkezik, mert beszélni akart kedvesével. Helyette azonban a rendőrfőnököt találja itt, aki meg is ragadja az alkalmat, hogy csak tovább szítsa az asszony szívében amúgy is ébredező féltékenységet. Ebben kettős cél vezeti: hogy Toscán keresztül elkaphassa a szökevényt s a szabadságharcos festőt; s hogy a szép Toscát is végre megszerezze magának.

Tosca és a rendőrfőnök, Scarpia hamarosan újra találkoznak a palota kápolnájában. Itt a kormány tart épp győzelmi ünnepséget arra a hírre, hogy Napoleon vereséget szenvedett. Az ünnepségen Tosca is részt vesz, mint énekesnő. A rendőrfőnök levélben értesítette őt, hogy szereplése után feltétlenül keresse fel.
Mindeközben Scarpia emberei átkutatták Cavaradossi nyaralóját, ahol Angelottit nem sikerült megtalálniuk, viszont magukkal hozták a festőt. Ekkor érkezik meg Tosca is. Szerelme szeméből rögtön kiolvassa a kérést: ne áruljon el semmit Scarpiának! Ám Scarpia kínzókamrába veti a festőt, s Tosca - szerelme egyre gyötrelmesebb kiáltásait hallva - megtörik, s elárulja a titkos búvóhelyet a nyaralóban. Cavaradossi hát megszabadul a kínzástól, de mikor megtudja, hogy ez Tosca árulásának köszönhető, felháborodva taszítja el magától kedvesét.
Ekkor váratlanul egy hírnök érkezi a hírrel, hogy Napoleon győzött az osztrák hadak felett. A hírre a festő boldogan kiáltja el magát, s ezzel végleg elárulja magát a rendőrfőnök előtt. Scarpia börtönbe veti, s másnap reggeli kivégzést rendel el.

Tosca kétségbe esik, de mindent megpróbál szerelme megmentéséért. Mikor megkérdezi Scarpiát, mennyi pénzért hajlandó elengedni Cavaradossit, az nyíltan így válaszol: "Úgy? Hát eladónak hitt? Jó, de hát az ilyen bájos asszony nem pénzen vesz meg engem!" Tosca előtt világos hát a választás: kedvese vagy meghal, vagy elfogadja a zsarnok becstelen ajánlatát, s megmenti szerelme életét. Mi mást választhatna, mint az utóbbit?

Scarpia azonban nem engedi szabadon tüstént a festőt. Elhiteti Toscával, hogy, ha az övé lesz, másnap a kivégzőosztag vaktöltényt fog csak használni, Cavaradossinak csak el kell majd játszania, mintha meghalna. Tosca gyanútlanul hisz neki. Főleg, hogy Scarpia még útlevelet is hajlandó kiállítani kettejük számára.
Ám mialatt Scarpia az útlevelet írja, Tosca magához vesz egy asztalon heverő kést, s mikor a az végzett a papírok megírásával s - egyezségük szerint - szerelmesen közeledni akar felé, leszúrja a férfit. Tosca az útlevelekkel a kezében azonnal menekül, fut Cavaradossihoz a jó hírrel.

Már hajnalodik, a festő a kivégzésére készül, mikor végre beszélni tudnak. Tosca boldogan újságolja neki a hírt: Scarpiát megölte, az útlevelek itt vannak a kezében, a kivégzéskor csak vaktöltényt fognak használni. Javasolja kedvesének, hogy tegyen úgy a lövések eldördülésekor, mintha holtan rogyna össze, s majd, ha tiszta lesz a terep, elszöknek.
Kezdődik a kivégzés, feláll a kivégzőosztag. Tosca egy oszlop mögül figyeli az egészet. Eldördülnek a fegyverek. Cavaradossi a földre zuhan. A katonák eltávoznak. Tosca azonnal szerelméhez rohan, s halkan szólítgatni kezdi. Ekkor eszmél csak rá, hogy becsapták mindkettőjüket: Cavaradossi halott...

Közben megtalálják Scarpia holttestét s nagy zajjal keresni kezdik a gyilkost. Tosca nem várja meg, míg rátalálnak: föllép a várfalra, s onnan leveti magát.